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等温滴定量热(ITC)
等温滴定量热(Isothermal Titration Calorimetry,简称ITC)是一种广泛应用于生物化学和药物研究领域的实验技术。它通过测量溶液中的热量变化,探究溶质与溶剂之间的相互作用。
ITC测试原理基于热力学法则,即溶液中的热量变化与化学反应或相互作用有关。仪器包含一个参照池和一个样品池。参照池通常加入纯水,样品池加入待研究对象中的一种(一般为大分子,如蛋白质),而滴定器里则装有另一种研究对象称之为配体(例如化合物)。在实验过程中,配体被可控地滴入样品池中(同时伴随充分混合),一般为0.5到2μL,直到样品池中的配体浓度2-3倍过量于样品池中的蛋白浓度。每次滴定会产生一个热量脉冲,通过对每一次滴定时热量的积分并对浓度进行归一化处理后生成摩尔放热量(kcal/mol)对摩尔比率(配体/样品)作图,再选择拟合合适的结合模型(Binding Models),获取结合相关的亲和力 (KD)、化学结合计量比 (n)、焓变 (ΔH) 和熵变 (ΔS)。
1. 制样要求
1) 强酸强碱不能检测;
2) 含固体样品,需提供溶解和清洗方法;
3) 样品性质要求:
a) 滴定液(滴定针中):透明均匀液体,无肉眼可见沉淀不能为悬浮液,或随时间或温度变化有固体析出;
b) 被滴定液(池体中):最好为透明均匀液体,可为悬浮液,但颗粒不能过大(纳微级尚可接受);
c) 滴定过程中避免大量沉淀产生或粘度改变;
d) 滴定液和被滴定液pH最好一致,相差最大不能超过0.2pH单位。
2. 样品要求
1) 样品量或样品尺寸的具体要求:
a) 池子样品:不少于4mL;
b) 进样针样品:不少于1mL(具体看需看样品测试情况,建议多一点);
2) 样品浓度说明:
c) 以摩尔浓度(mM)为标准,一般滴定液是被滴定液的10-20倍,如有参考文献可以参考文献浓度为参照;
d) 绝对浓度可以相关参考文献为参照,若无参考文献,对于小分子和蛋白相互作用体系可配制为小分子溶液200µM、蛋白溶液20µM;小分子和小分子之间确认为弱相互作用的体系,滴定针中的小分子溶液可配制为mM级,池体中溶液浓度可参照(1)的浓度比例配制;
3) 样品体积要求:一组样品测试包含滴定液(小分子)和被滴定液(蛋白或大分子)之间以及滴定液和溶剂之间的相互作用,所以滴定液和被滴定液为5mL,缓冲液可准备10mL;若增加滴定的小分子种类,则被滴定液和缓冲液体积则相应增加,同理增加被滴定液种类,则滴定液和缓冲液体积相应增加;推荐按测试组准备样品;
4) 默认放被滴定物的池子体积是1.44ml,一次性加满。
测试结果
蛋白质-蛋白质相互作用:ITC可以用于研究蛋白质之间的相互作用,帮助科学家揭示蛋白质复合物的形成和稳定性,进而了解生物过程中的调控机制。 蛋白质-小分子相互作用:ITC可以研究蛋白质与小分子配体(如药物分子)之间的相互作用,为药物设计和筛选提供重要信息。 核酸-核酸相互作用:ITC可以用于研究核酸(DNA、RNA)之间的相互作用,揭示基因表达调控的分子基础。 酶动力学:ITC可以测量酶与底物、抑制剂之间的相互作用,研究酶的催化机制和调控途径。 生物材料研究:ITC可以用于研究生物材料(如蛋白质、多糖)的组装和结构-功能关系。
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